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대한생식의학회지 제25권 제2호 2010년
인간 다-전핵기(>2PN) 수정란의 초급속 동결에 관한 연구
마리아 산부인과 기초의학연구소, 마리아 산부인과1, 건국대학교 축산대학2
김은영, 이봉경, 남화경, 이금실, 윤산현, 박세필, 정길생, 임진호,
Cryopreservation of Human Multi-Pronuclear (PN) Zygote by Ultra-Rapid Freezing
Kim ey, Yi bk, Nam hk, Lee ks, Yoon sh, Park sp, Chung ks, Lim jh
본 연구는 인간 전핵기 수정란의 동결시 electron microscope grid를 사용하는 초급속 동결방법이 유용하는지 여부를 조사하고자 실시하였다. 본 실험에서는 인간 IVF 시술시 생성되는 다-전핵기(>2PN) 수정란을 정상 2PN 수정란 대신 사용하였으며, 또한 이들은 3PN과 ≥4PN 수정란으로 나누어 전핵의 수에 따른 냉해와 융해 후 체외 배발달율을 조사하였다. 동해제는 30% ethylene glycol, 18% ficoll, 0.5 M sucrose와 10% FBS등이 D-PBS에 첨가되어 제작된 EFS30을 사용하였다. 본 연구에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 초급속동결-융해 후, 인간 다-전핵기 수정란의 생존율은 85.5% 였다. 대조군과 동결군의 난할율을 전핵의 수에 따라 나누어 비교하였을 때, 각 군간에는 유의한 차이를 나타내지 않았다 (3PN; 81.3% 와 85.4% , ≥4PN; 90.0% 와 95.7%). 또한, 융해 후 체외발달율을 조사하였던바, ≥4PN 수정란에서는 동결군 (4.5%) 의 체외발달이 대조군 (44.4%) 보다 유의하게 낮게 나타났던 반면, 3PN 수정란에서는 동결군 (22.0%) 의 결과가 대조군 (38.5%) 에 비해 유의한 차이를 나타내지 않았다 (p<0.05). 따라서 인간 다-전핵기 수정란은 EM grid와 EFS30 동결액을 이용한 초급속 동결로 배발달을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
Cryopreservation has now become an essential assisted reproduction technique in human in vitro fertilization (IVF) program for the patients to have the opportunity of pregnancies from more than one embryo transfer without having to be subjected to controlled ovarian hyperstimulation and oocyte retrieval each time (Abbeel et al., 1997; Baker, 1997). Human embryos have been cryopreserved at the unicellular pronuclear stage, at the multicellular cleavage stages or at the blastocyst stage using different freezing protocols with either dimethylsulfoxide (DMSO), 1,2-propanediol (PROH) or glycerol as cryoprotective agents (Trounson and Mohr, 1983; Cohen et al., 1988; Feichtinger et al., 1991; Veek et al., 1993; Kaufmann et al., 1995). Also, for these developmental stages freezing method has mainly employed slow controlled-rate cooling (Friedler et al., 1988). These methods require expensive equipment and are time-consuming. However, to elude these disadvantages, simpler and faster freezing methods have been developed such as vitrification (Rall and Fahy, 1985) and ultra-rapid freezing (Trounson et al., 1987). In addition, several pregnancies by ultra-rapid freezing were reported in human (Trounson, 1990; Barg and Feichtinger., 1990; Gordts et al., 1990; Feichtinger et al., 1991). On the other hand, Martino et al., (1996) demonstrated that highly developmental capacity of bovine oocytes can be obtained by a new ultra-rapid freezing method using electron microscope (EM) grids. This fact was proved in our results (Kim et al., 1998a,b). Based on these data, we tested whether the developmental capacity of human multi-pronuclear (PN) zygotes after ultra-rapid freezing using EM grids can be maintained.
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