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대한생식의학회지 제25권 제1호 2010년
EFS로 초자화 동결된 생쥐 미수정란의 체내/외 발달
마리아 기초의학 연구소, 1마리아 산부인과, 2건국대학교 축산대학
김묘경, 김은영, 이봉경, 윤산현1, 박세필, 정길생2, 임진호1,
In Vitro/In Vivo Development of Mouse Oocytes Vitrified by EFS
Kim mk, Kim ey, Yi bk, Yoon sh, Park sp, Chung ks, Lim jh
본 연구는 생쥐 미수정란을 초자화 동결하였을 때, 체내/외 발달율에 미치는 영향을 연구하고자 실시하였다. 생쥐 미수정란은 30, 35, 40% ethylene glycol, 18% ficoll 과 0.5 M sucrose가 함유된 M2 배양액으로 구성된 EFS30, 35, 40을 이용하여 초자화 동결되었다. 노출 또는 초자화 동결-융해 후, 형태학적으로 정상적인 미수정란은 1-2x106/ml 농도의 정자로 체외수정되었고, 수정율과 체내/외 발달율 그리고 배반포의 세포수 (inner cell mass 와 tropectoderm cell)가 조사되었다. 본 실험에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 35%의 ethylene glycol이 함유된 EFS35에서 EFS30과 EFS40보다 높은 분할율을 나타냈다. 초자화 동결-융해 후 체외수정된 미수정란의 2-세포기까지의 발달율 (51.1%) 은 동결없이 초자화 동결액에 노출만된 군 (60.0%) 과 대조군 (68.2%) 에 비해 유의하게 감소하였다 (p<0.05). 그러나 이들 처리군에 있어서 난할된 난자로 부터의 배반포기배까지의 발달율에는 유의한 차가 없었다 (75.0, 73.3 과 80.0%). 또한 초자화 동결된 군의 배반포기배 세포수 (92.5±2.9) 도 노출군 (98.5±5.3), 대조군 (100.9±4.8) 과 유사하였다. 초자화 동결-융해하여 얻어진 배반포기배를 가임신 생쥐에 이식하였을 때 체내발달율인 산자발달율 (50.7%) 과 착상율 (80.0%) 도, 대조군 (58.2, 78.2%) 과 유사하였다. 이러한 결과로 보아, 생쥐 미수정란은 ethylene glycol를 기본으로 한 EFS35라는 초자화 동결액을 이용하여 동결보존될 수 있음을 알 수 있었다.
Many investigators have reported that mammalian embryos could be successfully cryopreserved (Whittingham et al., 1972; Friedler et al., 1988; Kim et al., 1996a). However, developmental capacity of cryopreserved oocytes was still poor compared to that of embryonic stages, because the cryopreservation method of oocytes was not optimal resulting in overall reduced survival and fertilization rates (Glenister et al., 1987). These failure may be due to zona hardening (Carroll et al., 1990), spindle disruption (Aigner et al., 1992) and chromosome abnormality (Bouquet et al., 1992) by freezing. Earlier studies on oocytes cryopreservation have performed the slow or conventional cooling procedures using dimethylsulfoxide (DMSO) and 1,2-propanediol (Whittingham, 1972; Trounson and Kirby, 1989; Aigner et al., 1992). Recently, ultra-rapid freezing and vitrification which were rapid and simple freezing method (Kola et al., 1988; Nakagata, 1989; Kono et al., 1991) have been introduced in the oocytes cryopreservation. Shaw et al. (1991) reported high development rates of vitrified-thawed mouse oocytes after fertilization in vitro. Successful vitrification requires a high concentration of cryopreservation and optimal freezing procedure that minimize both osmotic damage and chemical toxicity. Kim et al. (1996a) reported that mouse zygotes could be vitrified by EFS40 which based on 40% ethylene glycol which exposed to EFS40 for 30 sec. However, unfertilized oocytes of mouse have lower permeability to cryoprotectant, thus sufficient time for the cryoprotectant to permeate into the cells is need (Rayos et al., 1994). Therefore, this study was conducted to select the optimal vitrification solution to maintain the survival of mouse oocytes. In vitro/in vivo development and cell number of cryopreserved mouse oocytes using selected vitrification solution were examined.
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